對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：White Spot Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【預(yù)期用途】
對蝦白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是白斑綜合癥桿狀病毒復(fù)合體引發(fā)的一種綜合性病癥。白斑綜合癥桿狀病毒復(fù)合體主要有皮下及造血組織壞死桿狀病毒、日本對蝦桿狀病毒、系統(tǒng)性外胚層和中胚層桿狀病毒及白斑桿狀病毒。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測對蝦白斑綜合癥病毒，對對蝦白斑綜合癥病毒的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）基因設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV） DNA模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | WSSV PCR反應(yīng)液 | 500 μL×1管 | 1000 μL×1管 |
2 | WSSV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | WSSV 陰性對照 | 40 μL 1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含對蝦白斑綜合癥靶基因的質(zhì)粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 樣品：受精卵、3cm以下幼蝦、仔蝦、幼體采集整條對蝦作為樣品；成蝦采集上皮、肝胰腺、腸或鰓作為樣品。
2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。
3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 WSSV 熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標(biāo)本中檢測出WSSV |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出WSSV |
【檢驗方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為103Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理規(guī)范進(jìn)行管理；
2. 為避免DNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。
